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| 導讀 | 質(zhì)譜技術 (mass spectrometry) 是分離和檢測帶電粒子質(zhì)荷比的分析技術。隨著離子源及質(zhì)量分析器技術的變革、質(zhì)譜儀器設計的快速改進等，質(zhì)譜技術已成為化學分析領域和生命科學領域非常有效的分析工具，尤其在醫(yī)學檢驗中的應用越來越為廣泛和深入。 |
質(zhì)譜技術 (mass spectrometry) 是分離和檢測帶電粒子質(zhì)荷比的分析技術。隨著離子源及質(zhì)量分析器技術的變革、質(zhì)譜儀器設計的快速改進等，質(zhì)譜技術已成為化學分析領域和生命科學領域非常有效的分析工具，尤其在醫(yī)學檢驗中的應用越來越為廣泛和深入。
由于質(zhì)譜技術的高特異性、高靈敏度、單次分析的快速性與檢測信息的豐富性，以及對復雜生物基質(zhì)分析的高耐受性等特點，臨床研究和診斷工作也逐漸倚重于此類重要的新型檢測技術。如：質(zhì)譜技術所能提供的豐富的檢測信息，有助于臨床更加完整地了解疾病和病理狀態(tài)，從而為患者提供更為全面和準確的診療服務。
在美國等發(fā)達國家，質(zhì)譜技術已廣泛應用于醫(yī)學檢驗，基于該技術開發(fā)出的臨床檢測項目已有數(shù)百項，但我國目前仍處于起步階段，檢測項目有70余項；應用覆蓋面非常廣泛，涵蓋了罕見和高難度分析，包括微生物鑒定、生化檢驗（激素檢測、藥物濃度監(jiān)測、遺傳性疾病檢測、營養(yǎng)素檢測等) 和分子生物診斷 (蛋白組學、核苷酸多態(tài)性、代謝組學) [1-5]；應用范圍也在逐步擴展，從生化檢驗、微生物鑒定，到代謝組學、脂質(zhì)組學、蛋白組學，再到參考測量程序的建立和校準品賦值，乃至術中應用及床旁檢測。
本文將全面闡述質(zhì)譜技術在醫(yī)學實驗室中的發(fā)展歷程，以及在醫(yī)學檢驗領域的主要應用情況和特點，同時剖析了質(zhì)譜技術目前在臨床應用中主要痛點和未來可能的發(fā)展方向，希望能較為全面地綜述質(zhì)譜技術臨床應用的現(xiàn)狀與未來。
一、質(zhì)譜技術在醫(yī)學實驗室中的發(fā)展
從質(zhì)譜技術初進入醫(yī)學檢驗領域，至今發(fā)展至多領域、寬范圍的應用，大約經(jīng)歷了四十年的時間，早始于20世紀80年代。由于免疫法檢測存在假陽性，質(zhì)譜技術開始從研究性實驗室走入臨床實驗室，如氣相色譜質(zhì)譜 (gas chromatography mass spectrometry, GC-MS) 技術起初應用于軍事藥物監(jiān)測。推動這種轉(zhuǎn)變出現(xiàn)的是發(fā)生在1981年的美國尼米茲號航空母艦事故。尼米茲號是美國一艘核動力航空母艦，1981年5月25日深夜，尼米茲號在準備回收模擬作戰(zhàn)歸來的機群時發(fā)生意外，引發(fā)大火，該事故終造成多人死傷。隨后采用免疫法檢測飛行員尿液樣本時發(fā)現(xiàn)，大部分尿檢結果中da麻代謝物呈陽性，表明軍中可能存在藥物濫用情況。
因免疫法檢測結果本身存在較高的假陽性率，所以需要使用更為特異的GC-MS方法進行確認。而GC-MS在應用后的10年里使大麻檢測陽性率從18%降低至8%，這也促使了質(zhì)譜技術進入毒理實驗室并應用于濫用藥物檢測和治療藥物監(jiān)測，臨床質(zhì)譜檢測開始萌芽。1988年，美國聯(lián)邦藥品檢驗局發(fā)布強制性指南，要求治療藥物監(jiān)測必須使用質(zhì)譜法進行確認，奠定了質(zhì)譜技術在治療藥物監(jiān)測中的重要地位[2]。
隨著GC-MS在醫(yī)學檢驗領域應用的逐步增多，免疫法用于類固醇激素檢測的缺點也日益凸顯，尤其是在測定婦女和兒童體內(nèi)低濃度睪酮時。但因GC-MS主要適用于揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性化合物，樣品制備程序復雜，檢測通量低，因此限制了其在臨床中的應用。20世紀80年代，快原子轟擊、電噴霧和輔助激光解析等“軟電離”技術的發(fā)展，使蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的檢測成為可能，大大拓展了質(zhì)譜技術在醫(yī)學檢驗領域的應用范圍[1]。
20世紀90年代，串聯(lián)質(zhì)譜技術開始應用于新生兒篩查。而電噴霧電離接口技術 (electrospray ionization interface technology, ESI) 發(fā)展使得兩種強有力的分析工具—液相系統(tǒng)和質(zhì)譜系統(tǒng)的結合成為了可能，兩者的結合也進一步促進了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS) 技術在醫(yī)學檢驗、臨床研究及疾病診斷的應用發(fā)展。液相色譜質(zhì)譜技術的聯(lián)用能夠使非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定生物分子電離并在極低的濃度下得到檢測，簡化了樣品制備流程，提高了檢測通量，極大縮短了報告周期，因而在臨床實驗室的常規(guī)檢測工作中得到了迅猛的發(fā)展。
21世紀初期，質(zhì)譜技術開始嘗試應用于感染性疾病的檢測，如血源性感染疾病的分子診斷?；|(zhì)輔助激光解吸電離技術 (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) 的發(fā)展則地實現(xiàn)了生物大分子的軟離子化，通過引入基質(zhì)分子，使待測分子不產(chǎn)生碎片，解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性生物大分子解吸離子化的問題，便捷地將生物樣本引入質(zhì)譜系統(tǒng)，并結合飛行時間質(zhì)量分析器 (time-of-flight, TOF) 技術，實現(xiàn)了微生物的快速鑒定分析，鑒定時間可縮短1.45d。相對于傳統(tǒng)的微生物檢測方法，MALDI-TOF可節(jié)省人力和時間，該應用也促進了質(zhì)譜技術在大分子檢測領域的廣泛使用，將質(zhì)譜的應用推上了一個新的臺階。
2013年，美國食品藥品監(jiān)督管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 認可使用MALDI-TOF對微生物進行鑒定。另外，近幾年還出現(xiàn)了將質(zhì)譜技術用于實時指導癌癥外科手術的前沿應用[2,5]。
在我國，質(zhì)譜技術在醫(yī)學檢驗中的應用早也始于治療藥物監(jiān)測。隨后，質(zhì)譜技術在遺傳代謝病檢測、營養(yǎng)素檢測和微生物鑒定工作中作出的突出貢獻，引起行業(yè)內(nèi)的廣泛關注。同時其在蛋白組學等研究領域也具有良好的前景，有望成為醫(yī)學檢驗領域繼基因測序技術之后的下一個革命性技術。
二、質(zhì)譜技術在醫(yī)學檢驗中的主要應用
1、質(zhì)譜技術在臨床生化檢驗中的應用
質(zhì)譜技術在應用較早的國家已成為繼免疫學方法和化學發(fā)光法之后的第三大生化檢測技術。目前采用質(zhì)譜技術檢測的項目數(shù)量雖然與其他兩種方法相比還有很大差距，但越來越多的生化檢測項目正被轉(zhuǎn)移至質(zhì)譜技術平臺進行檢測；質(zhì)譜技術也成為生化檢驗領域新興的發(fā)展方向和*的重要技術[6]。
質(zhì)譜技術在臨床生化檢驗中應用為成熟的項目主要包括：生化遺傳檢測、治療藥物監(jiān)測、類固醇激素檢測、營養(yǎng)素檢測以及毒理學檢測。技術高特異性的特點可有效避免結構類似物對檢測結果的影響，為臨床提供更準確的結果，提高患者的依從性。技術高靈敏度的特點可在很大程度上彌補內(nèi)分泌類固醇激素檢測中，低濃度化合物檢測困難和測不準的難題，為疾病的預測和診療分型提供準確結果。
國外許多內(nèi)分泌實驗室已經(jīng)將大部分體內(nèi)激素類物質(zhì)的檢測由放射免疫學方法或免疫學方法轉(zhuǎn)換為LC-MS/MS方法，并將質(zhì)譜技術作為內(nèi)分泌類固醇激素類物質(zhì)檢測的優(yōu)選方法。質(zhì)譜技術一次可檢測多種化合物的特點，可提高檢測通量、減少樣品用量和降低檢測成本。如在生化遺傳檢測中，質(zhì)譜技術一次可分析60多種氨基酸和酰基肉堿，篩查40余種新生兒遺傳代謝?。辉跔I養(yǎng)素檢測中一次可分析20種氨基酸、20種脂肪酸、10余種微量元素或5種脂溶性維生素，有效提高了檢測通量、減少了樣品用量，并提供了豐富的檢測信息；在毒理學檢測中一次可檢測尿液中19種藥物，實現(xiàn)了高通量、快速的藥物篩查技術[7]。
在臨床生化檢驗領域，質(zhì)譜技術相比于傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢較為突出，但隨著技術的深入應用與經(jīng)驗的積累，技術應用的缺點也逐步凸顯出來，包括質(zhì)譜技術應用的陷阱問題、實驗室日常運行過程中的管理問題以及相關政策法規(guī)問題等，主要體現(xiàn)在：
(1) 質(zhì)譜技術在分析基質(zhì)復雜的生物樣本時，檢測結果易受到基質(zhì)效應、結構類似物干擾以及質(zhì)譜信號產(chǎn)生的不穩(wěn)定所帶來的干擾影響；對這些問題認識和預防不當，則質(zhì)譜的檢測結果將存在較大的錯誤風險；
(2) 質(zhì)譜技術相比于免疫學方法和化學發(fā)光法，檢測的自動化程度較低，對人員依賴性較大；同時各廠家儀器系統(tǒng)還未實現(xiàn)與臨床實驗室信息管理系統(tǒng) (LIS) 的接口雙向?qū)?，在?shù)據(jù)處理和報告發(fā)放環(huán)節(jié)，仍未實現(xiàn)自動化；
(3) 對于質(zhì)譜技術應用較成熟的項目，檢測數(shù)據(jù)仍缺乏統(tǒng)一的應用標準[4]；
(4) 質(zhì)譜技術檢測方法所需的標準物質(zhì)、試劑和耗材等，目前主要依賴于進口，較多的檢測項目受限于這些因素而開展受阻；
(5) 目前質(zhì)譜實驗室的方法基本為自建方法，標準化和規(guī)范化較為薄弱。美國臨床實驗室標準化協(xié)會已發(fā)布了臨床質(zhì)譜的使用指南[8]，中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會、衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心和《中華檢驗醫(yī)學雜志》編輯部也于2017年10月份共同發(fā)布了《液相色譜-質(zhì)譜臨床應用建議》[9]，這些都為質(zhì)譜技術臨床檢測工作提供良好了的指導和參考；
(6) 由于質(zhì)譜技術較為復雜，儀器構成多樣化，在實際的應用過程中，需要有經(jīng)驗的專業(yè)技術人才進行規(guī)范的使用操作，但目前國內(nèi)相關的技術人才匱乏；質(zhì)譜實驗室的儀器設備昂貴，對于安裝條件有特殊要求，建設需要投入大量的資金；這些使得質(zhì)譜技術臨床應用的門檻較高，一定程度上限制了技術的應用；
(7) 在日常運營過程中儀器的維修服務成本較高，維修周期較長，維修的及時性也存在不能滿足臨床檢測的報告周期固定性的要求；
(8) 國內(nèi)對于質(zhì)譜技術在臨床的應用監(jiān)管還不成熟，相關的檢測項目在臨床上無收費標準，也在一定程度上限制了技術的應用普及。
雖然質(zhì)譜技術的應用仍存在較多缺陷，但隨著技術的革新與發(fā)展，應用監(jiān)管的成熟，各項瓶頸將被不斷突破，未來隨著質(zhì)譜儀器的各項性能的提升；前處理自動化的實現(xiàn)；檢測數(shù)據(jù)自動輸出并實現(xiàn)與實驗室信息系統(tǒng)的雙向?qū)?，以及結果報告自動預警功能的實現(xiàn)，質(zhì)譜儀有望像免疫學方法和化學發(fā)光法一樣，成為臨床生化檢驗中自動化、智能化、易用化的檢測平臺。
2、質(zhì)譜技術在微生物檢驗中的應用
近年來，MALDI-TOF技術已成功應用于微生物的鑒定及分型，并逐漸成為微生物鑒定的主流技術，可快速檢測和鑒定革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌、分枝桿菌、酵母菌和絲狀真菌等[6,10-14]。相比于傳統(tǒng)的革蘭染色、菌落形態(tài)、表型鑒定及分子生物學技術， MALDI-TOF技術具有快速、準確、經(jīng)濟、高通量等優(yōu)點。MALDI-TOF是基于細菌表面蛋白分子檢測的技術，通過測定未知微生物自身*的蛋白質(zhì)指紋圖譜及特征性的圖譜峰，并與數(shù)據(jù)庫中參考菌株的蛋白指紋圖譜進行比對，從而實現(xiàn)菌株的鑒定[11]。
該技術是將完整的微生物細胞直接進行檢測，樣品制備簡單，檢測周轉(zhuǎn)時間短，在數(shù)分鐘內(nèi)就可以得到一個菌種的測試結果，且分析用菌量極少，而傳統(tǒng)方法完成常規(guī)細菌鑒定至少需要8~18h或更長時間。MALDI-TOF通過檢測細菌胞膜成分或表達的特異蛋白對細菌進行種群的鑒別，敏感性和準確性高，可以區(qū)分表型相似或相同的菌株，提供屬、種、型水平的鑒定，對臨床常見分離菌鑒定到種水平的準確率很高。以16S r RNA基因測序結果為標準，質(zhì)譜檢測結果準確率為90.0%~95.0%[15]，不僅可以識別病原菌，而且有助于發(fā)現(xiàn)新的病原菌。此外，質(zhì)譜技術還用于病原體的藥物敏感性檢測，常規(guī)的藥物敏感性實驗方法比較費時，局限于少數(shù)細菌，MALDI-TOF通過比對耐藥菌株和藥物敏感菌株間的特征性蛋白和圖譜峰及檢測耐藥菌株與抗生素共培養(yǎng)后的分解產(chǎn)物，可以分析幾乎所有的耐藥機制。
研究表明，相比于標準的微生物培養(yǎng)技術，質(zhì)譜技術可降低約50%的試劑成本和勞動力成本[16]。但是，MALDI-TOF作為一項新興技術，在微生物鑒定方面也存在著一定的局限性。如對于具有特殊結構的菌種和圖譜極為相似的菌種的鑒定區(qū)分存在一定的難度、對于一些罕見菌種或新型細菌鑒定困難、對血培養(yǎng)樣本中的混合菌種難以準確鑒別等，原因是質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中標準菌株的圖譜有限、質(zhì)譜峰的數(shù)據(jù)不充分以及細菌庫中無這些菌株[17,18]。
隨著儀器技術參數(shù)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及分析軟件的不斷更新完善，所有的分離株將被逐步的明確鑒定出來。因此，隨著質(zhì)譜技術在臨床微生物實驗室的應用數(shù)據(jù)庫進一步完善，MALDI-TOF技術必將在微生物鑒定、菌種分型、同源分析、耐藥監(jiān)測等多方面發(fā)揮出更大作用，有望成為新一代病原微生物診斷的常規(guī)技術。
3、質(zhì)譜技術在核酸檢測中的應用
核酸質(zhì)譜檢測技術是在MALDI-TOF原理的基礎上，結合引物延伸分析法和堿基特異裂解分析法，針對雙鏈DNA的特性進行了特殊優(yōu)化，使樣品在電離過程中不產(chǎn)生或產(chǎn)生較少的碎片離子，可用于檢測核酸的分子量和研究基因組單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism, SNP) ，是近年來應用于臨床核酸檢測的新型軟電離生物質(zhì)譜[19]。相比于以凝膠電泳為基礎的測序法，質(zhì)譜技術具有分辨率高、分離速度快、雜質(zhì)干擾少的優(yōu)點，被廣泛應用于核酸測序、核酸指紋圖譜、核酸SNP分析等[20]。
SNP是指基因組DNA序列上某個位置單個核苷酸堿基的差異，即基因位點的突變，在人群中的發(fā)生頻率大于1%，是決定個體疾病易感性和藥物反應性差異的重要因素，通過分析突變的位點，可預測疾病，并提供診斷意見和指導用藥。MALDI-TOF分析檢測SNP是根據(jù)不同的分子量將等位基因排序，區(qū)分和鑒別相對分子量達7000左右 (含20多個堿基) 、僅存在1個堿基差別的不同DNA，可以地分辨到堿基種類。
藥物代謝酶遺傳多態(tài)性是產(chǎn)生藥物毒副作用、降低或喪失藥物療效的主要原因之一，通過檢測藥物代謝酶的基因型可對臨床用藥方案進行指導和調(diào)整，為臨床個體化用藥提供依據(jù)。以往檢測藥物代謝酶基因多態(tài)性通常采用化學法，依賴于核苷酸的互補性對核酸序列進行分析，對于序列的長度、復雜性、反應條件等都具有較高的要求，容易受到不同程度的化學因素干擾，導致檢測結果出現(xiàn)偏差。若能將化學和物理方法結合起來對藥物代謝酶基因進行檢測，將極大提高檢測結果的準確性。
MALDI-TOF是藥物代謝酶基因多態(tài)性的新型檢測方法，其根據(jù)核苷酸分子被電離后在真空管中的飛行時間來確定其分子量大小，終確定核苷酸序列，檢測結果僅僅依賴于核酸分子量。經(jīng)過驗證比較，MALDI-TOF檢測結果與Sanger測序的結果符合率為100%[21,22]。傳統(tǒng)的Sanger測序方法雖然是序列測定的金標準，但其操作步驟繁瑣費時和試劑成本高等限制了其臨床應用。MALDI-TOF可通過一次實驗檢測多個標本的多個突變，實現(xiàn)基因型的高通量、快速檢測，為個體化用藥提供更加多樣化的檢測手段。
4、質(zhì)譜技術在蛋白質(zhì)組學中的應用
質(zhì)譜技術可檢測蛋白質(zhì)的氨基酸組成、分子量、多肽或二硫鍵的數(shù)目與位置及蛋白質(zhì)的空間構象等，從而實現(xiàn)未知肽段的篩選、測序、肽指紋圖譜、蛋白質(zhì)表達譜、蛋白質(zhì)翻譯后修飾譜、全蛋白完整無損分析等。質(zhì)譜多樣化的前端連接方式極大地促進了研究者對基礎蛋白科學領域的認識，但將這些認識轉(zhuǎn)變?yōu)閷εR床實踐的有效信息則有相當大的難度。到目前為止，基于質(zhì)譜技術的將蛋白組學多樣性的蛋白和多肽標志物， 成功應用于臨床檢測的案例并不多見[22]。
相反，對于已知的、確定的多肽和蛋白標志物即目標蛋白組學，質(zhì)譜技術得到了較好的應用。目前，已經(jīng)有一些關于LC-MS/MS用于臨床目標多肽和蛋白分析的文章發(fā)表，如甲狀腺球蛋白 (Tg) 和淀粉樣蛋白的鑒定與定量分析等[23-25]。質(zhì)譜技術在這一領域的應用，在很多情況下均可為臨床提供有價值的信息[21]，如對某一分析物的免疫學方法不存在時；已經(jīng)存在的免疫學方法不能給出某些臨床關鍵問題的答案時；已經(jīng)存在的免疫學方法存在干擾時；某一分析物存在多個異構體時；對同一分析物的檢測，不同的檢測方法間存在較大的結果變異性時；已經(jīng)存在的分析方法流程較為復雜時，質(zhì)譜技術均可發(fā)揮相應作用，彌補免疫學方法的不足。
質(zhì)譜技術在醫(yī)學檢驗領域中應用的下個目標和挑戰(zhàn)，是如何彌補免疫學方法在蛋白和多肽檢測方面的局限性。相信隨著技術的發(fā)展，這方面的突破會越來越多，為臨床提供更多的有價值的質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)。（轉(zhuǎn)化醫(yī)學網(wǎng)）
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