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選擇并制備合適的親和吸附劑是親和層析的關(guān)鍵步驟之一。它包括基質(zhì)和配體的選擇、基質(zhì)的活化、配體與基質(zhì)的偶聯(lián)等等。
基質(zhì)
基質(zhì)的性質(zhì)
基質(zhì)構(gòu)成固定相的骨架，親和層析的基質(zhì)應該具有以下一些性質(zhì)：
1.具有較好的物理化學穩(wěn)定性。在與配體偶聯(lián)、層析過程中配體與待分離物結(jié)合、以及洗脫時的pH、離子強度等條件下，基質(zhì)的性質(zhì)都沒有明顯的改變。
2.能夠和配體穩(wěn)定的結(jié)合。親和層析的基質(zhì)應具有較多的化學活性基團，通過一定的化學處理能夠與配體穩(wěn)定的共價結(jié)合，并且結(jié)合后不改變基質(zhì)和配體的基本性質(zhì)。
3.基質(zhì)的結(jié)構(gòu)應是均勻的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以使被分離的生物分子能夠均勻、穩(wěn)定的通透，并充分與配體結(jié)合。基質(zhì)的孔徑過小會增加基質(zhì)的排阻效應，使被分離物與配體結(jié)合的機率下降，降低親和層析的吸附容量。所以一般來說，多選擇較大孔徑的基質(zhì)，以使待分離物有充分的空間與配體結(jié)合。
4.基質(zhì)本身與樣品中的各個組分均沒有明顯的非特異性吸附，不影響配體與待分離物的結(jié)合?；|(zhì)應具有較好的親水性，以使生物分子易于靠近并與配體作用。
一般纖維素以及交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝膠排阻層析的凝膠都可以作為親和層析的基質(zhì)，其中以瓊脂糖凝膠應用為廣泛。纖維素價格低，可利用的活性基團較多，但它對蛋白質(zhì)等生物分子可能有明顯的非特異性吸附作用，另外它的穩(wěn)定性和均一性也較差。交聯(lián)葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化學穩(wěn)定性較好，但它們的孔徑相對比較小，而且孔徑的穩(wěn)定性不好，可能會在與配體偶聯(lián)時有較大的降低，不利待分離物與配體充分結(jié)合，只有大孔徑型號凝膠可以用于親和層析。多孔玻璃珠的特點是機械強度好，化學穩(wěn)定性好。但它可利用的活性基團較少，對蛋白質(zhì)等生物分子也有較強的吸附作用。瓊脂糖凝膠則基本可以較好的滿足上述四個條件，它具有非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑均勻適當、宜于活化等優(yōu)點，因此得到了廣泛的應用。瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時分別稱為2B、4B、6B。因為Sepharose 4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應用廣。
基質(zhì)的活化
基質(zhì)的活化是指通過對基質(zhì)進行一定的化學處理，使基質(zhì)表面上的一些化學基團轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結(jié)合的活性基團。配體和基質(zhì)的偶聯(lián)，通常首先要進行基質(zhì)的活化。
多糖基的活化
多糖基質(zhì)尤其是瓊脂糖是一種常用的基質(zhì)。瓊脂糖通常含有大量的羥基，通過一定的處理可以引入各種適宜的活性基團。瓊脂糖的活化方法很多，下面介紹一些常用的活性基團及活化方法。
1.溴化氰活化
溴化氰活化法是常用的活化方法之一，活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團，它可以和伯氨基（NH2）反應，主要生成異脲衍生物。
溴化氰活化的基質(zhì)可以在溫和的條件下與配體結(jié)合，結(jié)合的配體量大。利用溴化氰活化的基質(zhì)通過進一步處理還可以得到很多其它的衍生物。這種方法的缺點是溴化氰活化法的基質(zhì)和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常會帶一定的正電荷，從而使基質(zhì)可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質(zhì)與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定，尤其是當與小配體結(jié)合時，可能會出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象。另外溴化氰you劇毒、易揮發(fā)，所以操作不便。
2.環(huán)氧乙烷基活化
這類方法活化后的基質(zhì)都含有環(huán)氧乙烷基。如在含有NaBH4的堿性條件下，1，4－丁二醇－雙縮水甘油醚的一個環(huán)氧乙烷基可以與羥基反應，而將另一個環(huán)氧乙烷基結(jié)合在基質(zhì)上。另外也可以用環(huán)氧氯丙烷活化，將環(huán)氧乙烷基結(jié)合在基質(zhì)上。
這種活化方法的優(yōu)點是活化后不引入電荷基團，而且基質(zhì)與配體形成的N－C、O－C和S－C鍵都很穩(wěn)定，所以配體與基質(zhì)結(jié)合緊密，親和吸附劑使用壽命長，而且便于在親和層析中使用較強烈的洗脫手段，另外這種處理方法沒有溴化氰的毒性。它的缺點是用環(huán)氧乙基活化的基質(zhì)在與配體偶聯(lián)時需要堿性條件，pH為9~13，溫度為20~40? C。這樣的條件對于一些比較敏感的配體可能不適用。
上面兩種方法是比較常用的方法，另外還有很多種活化方法如：N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化、三嗪（triazine）活化、高碘酸鹽（periodate）活化、羰酰二咪唑（carbonyldiimidazole）活化、2,4,6－三氟5－氯吡啶（FCP）活化、乙二酸酰肼（adipic acid dihydrazide）活化、二乙xi砜（divinylsulfone）活化等，總之，目前對基質(zhì)的活化方法很多，各有其特點，應根據(jù)實際需要選擇適當?shù)幕罨椒ā?/p>
聚丙烯酰胺的活化
聚丙烯酰胺凝膠有大量的甲酰胺基，可以通過對甲酰胺基的修飾而對聚丙烯酰胺凝膠進行活化。一般有以下三種方式：氨乙基化作用、肼解作用和堿解作用。另外在偶聯(lián)蛋白質(zhì)配體時也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝膠。
多孔玻璃珠的活化
對于多孔玻璃珠等無機凝膠的活化通常采用硅烷化試劑與玻璃反應生成烷基胺－玻璃，在多孔玻璃上引進氨基，再通過這些氨基進一步反應引入活性基團，與適當?shù)呐潴w偶聯(lián)。
間隔臂分子
在親和層析中，由于配體結(jié)合在基質(zhì)上，它在與待分離的生物大分子結(jié)合時，很大程度上要受到基質(zhì)和待分離的生物大分子間的空間位阻效應的影響。尤其是當配體較小或待分離的生物大分子較大時，由于直接結(jié)合在基質(zhì)上的小分子配體非?？拷|(zhì)，而待分離的生物大分子由于受到基質(zhì)的空間障礙，使得其與配體結(jié)合的部位無法接近配體，影響了待分離的生物大分子與配體的結(jié)合，造成吸附量的降低。解決這一問題的方法通常是在配體和基質(zhì)之間引入適當長度的“間隔臂”，即加入一段有機分子，使基質(zhì)上的配體離開基質(zhì)的骨架向外擴展伸長，這樣就可以減少空間位阻效應，大大增加配體對待分離的生物大分子的吸附效率。加入手臂的長度要恰當，太短則效果不明顯；太長則容易造成彎曲，反而降低吸附效率。
引入間隔臂分子常用的方法是將適當長度的氨基化合物NH2 (CH2)n R共價結(jié)合到活化的基質(zhì)上，R通常是氨基或羧基，n一般為2－12。例如Pharmacia公司生產(chǎn)的AH－Sepharose 4B和CH－Sepharose 4B就是分別將1,6－乙二胺，6－氨基乙酸與CNBr活化的瓊脂糖反應引入間隔臂分子。二者的末端分別為氨基或羧基，通過碳二亞胺的縮合作用可以分別與含羧基或氨基的配體偶聯(lián)。
另外也可以通過進一步的活化處理，生成N－羥基琥珀酰亞胺酯、環(huán)氧基等活性基團直接與各種配體偶聯(lián)。引入間隔臂的基質(zhì)與配體結(jié)合時，配體就可以離開基質(zhì)一定的空間，從而可以減少空間位阻效應，易于與待分離物質(zhì)結(jié)合。
配體
配體的性質(zhì)
親和層析是利用配體和待分離物質(zhì)的親和力而進行分離純化的，所以選擇合適的配體對于親和層析的分離效果是非常重要的。理想的配體應具有以下一些性質(zhì)：
1.配體與待分離的物質(zhì)有適當?shù)挠H和力。親和力太弱，待分離物質(zhì)不易與配體結(jié)合，造成親和層析吸附效率很低。而且吸附洗脫過程中易受非特異性吸附的影響，引起分辨率下降。但如果親和力太強，待分離物質(zhì)很難與配體分離，這又會造成洗脫的困難?？傊?，配體和待分離物質(zhì)的親和力過弱或過強都不利于親和層析的分離。應根據(jù)實驗要求盡量選擇與待分離物質(zhì)具有適當?shù)挠H和力的配體。
2.配體與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強的特異性，也就是說配體與待分離物質(zhì)有適當?shù)挠H和力，而與樣品中其它組分沒有明顯的親和力，對其它組分沒有非特異性吸附作用。這是保證親和層析具有高分辨率的重要因素。
3.配體要能夠與基質(zhì)穩(wěn)定的共價結(jié)合，在實驗過程中不易脫落，并且配體與基質(zhì)偶聯(lián)后，對其結(jié)構(gòu)沒有明顯改變，尤其是偶聯(lián)過程不涉及配體中與待分離物質(zhì)有親和力的部分，對二者的結(jié)合沒有明顯影響。
4.配體自身應具有較好的穩(wěn)定性，在實驗中能夠耐受偶聯(lián)以及洗脫時可能的的較劇烈的條件，可以多次重復使用。
*上述條件的配體實際上很難找到，在實驗中應根據(jù)具體的條件來選擇盡量滿足上述條件的適宜的配體。
根據(jù)配體對待分離物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體（specific ligand）和通用性配體（general ligand）。特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素－受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性，用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體。配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素，但尋找特異性配體一般是比較困難的，尤其對于一些性質(zhì)不很了解的生物大分子，要找到合適的特異性配體通常需要大量的實驗。解決這一問題的方法是使用通用性的配體。通用性配體一般是指特異性不是很強，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各種凝集素（lectine）可以結(jié)合各種糖蛋白，核酸可以結(jié)合RNA、結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)等。通用性配體對生物大分子的專一性雖然不如特異性配體，但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。而且這些配體還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價格便宜等優(yōu)點，所以在實驗中得到了廣泛的應用。
配體與基質(zhì)的偶聯(lián)
除了前面已經(jīng)介紹了基質(zhì)的一些活化基團外，通過對活化基質(zhì)的進一步處理，還可以得到更多種類的活性基團。這些活性基團可以在較溫和的條件下與含氨基、羧基醛基、酮基、羥基、硫醇基等多種配體反應，使配體偶聯(lián)在基質(zhì)上。另外通過碳二亞胺、戊二醛等雙功能試劑的作用也可以使配體與基質(zhì)偶聯(lián)。以上這些方法使得幾乎任何一種配體都可以找到適當?shù)姆椒ㄅc基質(zhì)偶聯(lián)。關(guān)于配體和基質(zhì)偶聯(lián)的具體實驗操作可以參閱本書后面的實驗部分或相應的參考文獻。
配體和基質(zhì)偶聯(lián)完畢后，必須要反復洗滌，以去除未偶聯(lián)的配體。另外要用適當?shù)姆椒ǚ忾]基質(zhì)中未偶聯(lián)上配體的活性基團，也就是使基質(zhì)失活，以免影響后面的親和層析分離。例如對于能結(jié)合氨基的活性基團，常用的方法是用2－乙醇胺、氨基乙烷等小分子處理。
配體與基質(zhì)偶聯(lián)后，通常要測定配體的結(jié)合量以了解其與基質(zhì)的偶聯(lián)情況，同時也可以推斷親和層析過程中對待分離的生物大分子吸附容量。配體結(jié)合量通常是用每毫升或每克基質(zhì)結(jié)合的配體的量來表示。測定配體結(jié)合量的方法很多，下面簡單介紹幾種：
1.差量分析：根據(jù)加入配體的總量減去配體與基質(zhì)偶聯(lián)后洗滌出來的量即可大致推算出配體的結(jié)合量。當配體可以用光譜法準確定量時，這種方法還是相當準確的。
2.直接光譜測量：對于能夠吸收250nm以上波長的配體，可以直接用光譜法測定與基質(zhì)結(jié)合的配體的量。
3.凝膠溶解：通過適當?shù)姆椒▽⒛z溶解，如75 ?C下與酸或堿作用，而后直接用光譜法測量。
4.酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基質(zhì)釋放出配體或配體的裂解物進行分析。
5.2,4,6－三硝基苯磺酸鈉（TNBS）分析：利用TNBS與未結(jié)合配體和結(jié)合某些配體的基質(zhì)作用呈現(xiàn)不同的顏色，可以計算出配體結(jié)合量
6.元素分析：如果配體中含有某種特別的元素，通過元素分析就可以確定配體結(jié)合量。
7.放射性分析法：偶聯(lián)中加入一定量帶有同位素的配體，通過放射性分析確定配體結(jié)合量，這是一種非常靈敏的方法。
影響配體結(jié)合量的因素很多，包括基質(zhì)和配體的性質(zhì)、基質(zhì)的活化方法及條件、基質(zhì)和配體偶聯(lián)反應的條件等等。例如通常溴化氰活化的基質(zhì)的活性基團比環(huán)氧基活化的基質(zhì)多，配體結(jié)合量可能較大。在用溴化氰活化時，增加溴化氰的量及反應的pH，可以增加基質(zhì)上活化基團的量，從而增大配體結(jié)合量。偶聯(lián)過程中增加配體的量及增大反應的pH，也可以增大配體結(jié)合量。實驗中通常希望配體結(jié)合量較高，但應注意增加配體結(jié)合量應根據(jù)實際情況，還要考慮到其它因素的影響。因為提高配體的結(jié)合量不等價于提高親和吸附劑的吸附容量，配體結(jié)合量只是影響親和吸附劑吸附容量的一個因素，還有很多因素，如基質(zhì)、配體以及待分離物質(zhì)本身的性質(zhì)，配體在基質(zhì)的結(jié)合情況以及后面要介紹的實驗操作條件等都可能對親和吸附劑的吸附容量產(chǎn)生很大的影響。例如增大配體的結(jié)合量通?？梢栽黾游饺萘浚行┰龃笈潴w結(jié)合量的條件可能會影響配體的結(jié)構(gòu)，降低配體和待分離物質(zhì)的親和力，這樣反而會降低親和吸附劑的吸附容量。實際影響親和吸附劑吸附容量的因素是非常復雜的，各種因素的影響都不是絕dui的，要獲得較高的吸附容量往往要考慮很多因素，并通過實驗摸索來選擇合適的條件。
目前已有多種活化的基質(zhì)以及偶聯(lián)各種配體的親和吸附劑制成商品出售，可以省去基質(zhì)活化，配體偶聯(lián)等復雜的步驟。使用方便，效果好，但一般價格昂貴。
親和吸附劑的再生和保存
親和吸附劑的再生就是指使用過的親和吸附劑，通過適當?shù)姆椒ㄊ谷コ皆谄浠|(zhì)和配體（主要是配體）上結(jié)合的雜質(zhì)，使親和吸附劑恢復親和吸附能力。一般情況下，使用過的親和層析柱，用大量的洗脫液或較高濃度的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡即可再次使用。但在一些情況下，尤其是當待分離樣品組分比較復雜的時候，親和吸附劑可能會產(chǎn)生較嚴重的不可逆吸附，使親和吸附劑的吸附效率明顯下降。這時需要使用一些比較強烈的處理手段，使用高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑或加入適當?shù)姆菍Ｒ恍缘鞍酌?。但如果配體是蛋白質(zhì)等一些易于變性的物質(zhì)，則應注意處理時不能改變配體的活性。
親和吸附劑的保存一般是加入0.01%的疊氮hua鈉，4℃下保存。也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。應注意不要使親和吸附劑冰凍。
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