久久精品国产精品亚洲艾-亚洲不卡精品在线观看-夜夜嗨av一区二区精品-欧美日韩视频在线观看一区二区

一、培養(yǎng)細(xì)胞（culture cell）樣品處理方法：

培養(yǎng)動物組織細(xì)胞由于沒有細(xì)胞壁，因此可以將細(xì)胞收集下來，直接加入裂解緩沖液（Lysis buffer）抽提總蛋白。裂解緩沖液有多種配方，本實驗室主要采用如下成份：

1. 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％ Pharmalyte pH 3-10.

其他常用的裂解緩沖液如下：

2. 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3-10,1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;

3. 加入 0.3-1% SDS 在 95 C 煮樣品 5mins，冷卻后加入至少 5倍體積的（A）或（B）裂解液。

總蛋白抽提程序：

1. 培養(yǎng)細(xì)胞的收集；

2. 用磷酸緩沖液（PBS）洗細(xì)胞 3 次（室溫，1000g，各 2min）；

3. 將細(xì)胞分裝到 1.5ml Eppendof管中，吸干殘留的 PBS；

5. 4 C，40,000g，離心 1h；

6. 吸取上清并用 Brandford 法定量蛋白，然后分裝至 Eppendof 管里保存在-78℃?zhèn)溆谩?/p>

二、組織樣品處理方法：

對大多數(shù)從動物或植物組織里提取總蛋白質(zhì)而言，同樣沒有一種通用的程序。但遵循的原則基本相同。下面列出一種對植物樹葉總蛋白的方法。

三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物樹葉總蛋白程序：

1. 在液氮中研碎葉片；

2.  懸浮于含 10％三氯醋酸（TCA）和 0.07%β-巰基乙醇(可用 DTT替代)的丙酮溶液在－20℃  的冰浴；

3. 讓蛋白質(zhì)沉淀過夜然后離心（4 C，40,000g, 1h），棄上清；

4. 重懸沉淀浮于含 0.07%β-巰基乙醇的冰預(yù)冷丙酮溶液里；

5. 離心（4 C，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀；

6. 用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，離心（4 C，40,000g, 1h）。

7. Brandford 法定量蛋白，然后分裝至 Eppendof 管里保存在-78℃?zhèn)溆谩?/p>

超速離心法：

1. 取材；

2. 用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末，每1g樣品加入0.5ml裂解液，使用組織勻漿器勻漿30 s；

3. 組織懸液15℃，10 000× g離心10 min；

4. 上清液4℃，150 000× g超速離心45 min；

5. 小心避開上層漂浮的脂質(zhì)層，吸取離心上清6℃ 40,000g再次離心50 min；

6. 取離心上清。Bradford法定量，分裝后置-75℃保存。