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His-tag蛋白純化篇
1.蛋白不吸附或親和力低
首先確認(rèn)純化前的樣品中是否有目標(biāo)蛋白。
（1）有目標(biāo)蛋白，但大量穿透：
a、蛋白不含有標(biāo)簽或未能正確表達(dá)
解決措施：Western Blot鑒定目標(biāo)蛋白是否有His-Tag。若沒(méi)有，需要重新構(gòu)建載體，添加組氨酸標(biāo)簽，并確認(rèn)標(biāo)簽正確表達(dá)。
b、蛋白折疊導(dǎo)致組氨酸標(biāo)簽未*暴露
解決措施：
在不變性條件下純化蛋白，在樣品和平衡緩沖緩沖液中加1-2M尿素，這樣蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，而蛋白不會(huì)變性。
在變性條件下純化蛋白，加入4~8M尿素或4~6M鹽酸胍使蛋白變性。如果蛋白有二硫鍵，可加1-2mM DTT或1~5mM巰基乙醇（在樣品中添加），可以改善蛋白的吸附。
重新構(gòu)建載體，將組氨酸標(biāo)簽換到另外一端，或在組氨酸標(biāo)簽基因與目的基因之間增加一段Linker，可以降低蛋白折疊后標(biāo)簽被掩蓋的幾率。
c、標(biāo)簽太短
解決措施：將標(biāo)簽的組氨酸數(shù)量增加至6-10個(gè)。
d、蛋白標(biāo)簽被水解
解決措施：添加合適的蛋白酶抑制劑；盡量在低溫下處理樣品；對(duì)于分泌表達(dá)的蛋白，長(zhǎng)時(shí)間存放將增加蛋白被降解的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)盡快處理樣品。
e、蛋白溶解度偏低或聚集
解決措施：在結(jié)合緩沖液中添加0.5%-1% Tween-20、Triton X-100，或5%~50%的甘油，可以增加蛋白的溶解度，減少蛋白聚集。
f、樣品及結(jié)合緩沖液不合適
解決措施：確認(rèn)樣品及緩沖液中不含有EDTA、還原劑等。另外，將樣品及結(jié)合緩沖液pH調(diào)節(jié)至7.4~8.5，有利于蛋白結(jié)合。
（2）有目標(biāo)蛋白，但含量很低：
蛋白表達(dá)量低。解決措施：對(duì)樣品進(jìn)行濃縮，增加磁珠用量、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間；優(yōu)化表達(dá)條件（誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間，培養(yǎng)基等）；或更換其他合適的表達(dá)載體或表達(dá)系統(tǒng)。
2.純化得到的蛋白量少
（1）磁珠用量不足。本產(chǎn)品磁珠懸液濃度為10%，對(duì)于親和力較高的蛋白，每毫升磁珠懸液可結(jié)合的蛋白量約為3~4mg。用戶需要根據(jù)目標(biāo)蛋白含量，使用足夠量的磁珠。對(duì)于親和力較低的蛋白，需要增加磁珠用量，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，或提高樣品及結(jié)合緩沖液pH。
（2）蛋白與磁珠親和力較低。參考問(wèn)題1。
（3）蛋白濃度低。對(duì)樣品進(jìn)行濃縮，或增加磁珠用量、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。
（4）磁珠重復(fù)使用次數(shù)太多。將磁珠進(jìn)行再生處理（參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)）。
3.洗脫產(chǎn)物雜帶多什么原因？怎么處理？
（1）雜蛋白吸附。由于組氨酸，色氨酸，半胱氨酸等是蛋白質(zhì)中很常見(jiàn)基團(tuán)，而蛋白折疊可能導(dǎo)致幾個(gè)這樣的氨基酸殘基臨近，這樣也會(huì)使它們和磁珠的作用力增加?？梢杂貌煌瑵舛鹊倪溥蜻M(jìn)行梯度洗脫，在樣品及平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton X-100，或5~50%的甘油，可以避免因?yàn)槭杷嗷プ饔脤?dǎo)致非特異吸附，或使用鈷離子螯合磁珠（BeaverbeadsTM IDA-Cobalt）。此外，要獲得純度較高的蛋白，需要對(duì)裂解、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液的組分、pH、咪唑濃度等進(jìn)行優(yōu)化。若還是不能獲得高純度的蛋白，則需要考慮使用多步純化，結(jié)合使用離子交換、凝聚過(guò)濾等純化方法。
（2）菌體破碎條件太劇烈導(dǎo)致蛋白斷裂。確保在冰浴條件下破碎；降低超聲破碎的強(qiáng)度，縮短時(shí)間；適當(dāng)稀釋樣品，添加核酸酶，降低樣品粘稠度。
（3）蛋白被部分水解。添加合適的蛋白酶抑制劑，并盡可能在低溫下操作。
4.目標(biāo)蛋白難洗脫
穿透組分中目標(biāo)蛋白明顯減少，而洗脫組分中目標(biāo)蛋白很少，取少量磁珠加SDS-PAGE Loadding Buffer于95℃加熱5~10min，離心跑電泳，如果發(fā)現(xiàn)較多蛋白殘留。
（1）洗脫調(diào)節(jié)太溫和。提高洗脫液咪唑濃度至700mM還不能洗脫時(shí)，可以嘗試降低洗脫液pH至4.0，但低pH會(huì)也導(dǎo)致金屬離子脫落，磁珠需要再生后再使用。
（2）蛋白吸附在磁珠上無(wú)法洗脫。對(duì)于非特異性疏水吸附的蛋白，可以增加NaCl濃度至1M，或添加0.1%~2%的Triton X-100洗脫。對(duì)于聚集沉淀在磁珠上的蛋白（尤其注意含有二硫鍵的蛋白），可以在洗脫緩沖液中加入6M鹽酸胍進(jìn)行變性洗脫。
5.磁珠再生后，蛋白純化效果變差怎樣改善?
（1）再生過(guò)程的堿處理可以改善再生磁珠的蛋白純化效果，參考海貍生物醫(yī)學(xué)《組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒》說(shuō)明書(shū)中磁珠再生部分步驟4。
（2）重新掛金屬離子后為清洗干凈，需要增加洗滌步驟。殘留的金屬離子優(yōu)先跟蛋白結(jié)合，影響蛋白與磁珠的結(jié)合。
6.緩沖液中咪唑添加的意義
（1）結(jié)合緩沖液中低濃度的咪唑是為了減少雜蛋白的非特異性吸附；
（2）洗滌緩沖液中低濃度咪唑是為了吸取吸附能力較弱的雜蛋白；
（3）洗脫液中高濃度咪唑是為了洗脫目的蛋白。
7.IDA-鎳和IDA-鈷的區(qū)別
IDA-鎳的蛋白載量高，40mg/mLgel，純度稍低，純度有90%。
IDA-鈷的蛋白載量稍低,25mg/mLgel,純度達(dá)到95%。
一般客戶建議購(gòu)買(mǎi)IDA-鎳磁珠，即可達(dá)到目的。
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