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一、分離純化的基本原理
研究基因的表達(dá)和調(diào)控時(shí)常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫，RT-PCR和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。
二、試劑和材料
無水乙醇、氯fang、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）
三、準(zhǔn)備工作
RNase酶非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解zui主要的物質(zhì)。它在一些的條件可以暫時(shí)失活，但限制因素去除后有迅速復(fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase*失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須戴手套。 RNase的又一污染源是取液器，根據(jù)取液器制造商的要求對(duì)取液器進(jìn)行處理。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，基本達(dá)到要求。取RNase-free的物品時(shí)必須戴手套。
1、 料制品的處理 盡可能使用無菌，一次性塑料制品，已標(biāo)明RNase-Free 的塑料制品，如沒有開封使用過通常沒有必要再次處理。對(duì)于國產(chǎn)塑料制品，原則上都必須處理方可使用。
處理步驟如下：
1）在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注意：DEPC為劇毒物，活性很強(qiáng)，小心在通風(fēng)柜中使用。
2）處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通風(fēng)柜中室溫處理過夜。
4）將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水處理過的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。
5）烘箱用合適的溫度烘拷至干燥。置于干凈處備用。
2、 璃玻和金屬物品 250°C烘烤3小時(shí)以上。
四、從組織中提取總RNA
1)液氮研磨：組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/ml Trizol加入Trizol，轉(zhuǎn)入離心管進(jìn)行第2步操作。
2) 勻漿：組織樣品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外，組織體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果會(huì)不好，用電動(dòng)勻漿器充分勻漿約需1-2分鐘。
五、從細(xì)胞中提取總RNA
1) 培養(yǎng)貼壁細(xì)胞：不須消化，可直接用Trizol進(jìn)行消化、裂解，Trizol
體積按10cm2
/ml比例加入。
2) 懸浮細(xì)胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×10 6動(dòng)物、植物或酵母細(xì)胞，或10 7細(xì)菌細(xì)胞。
六、操作步驟
1、細(xì)胞或組織加Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。注：此時(shí)可放入-70℃長期保持。
2、12,000rpm 離心5min，棄沉淀。
3、按200ul氯fang/ml Trizol加入氯fang，振蕩混勻后室溫放置15min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。
4、4℃ 12,000g離心15min。
5、吸取上層水相，至另一離心管中。注：千萬不要吸取中間界面；若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，則棄下層酚相。
6、按0.5ml異丙醇/ml Trizol 加入異丙醇混勻，室溫放置5-10min。
7、4℃ 12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。
8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g離心5min，盡量棄上清。
10、室溫晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。
11、可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA樣品，55-60℃,5-10min。
注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。
12、測O.D值定量RNA濃度。注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之間；產(chǎn)率估計(jì)：組織標(biāo)本：（ug RNA/mg組織）1-10ug，培養(yǎng)細(xì)胞（ug RNA/10 6 Cell）：5-15ug。
注：組織或細(xì)胞量過少，可酌情減少Trizol用量；組織或細(xì)胞用量過多，會(huì)引起DNA對(duì)RNA的污染；
高蛋白、脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨后須4℃ 12,000g離心10min去掉不溶物，再進(jìn)行下面操作，若頂層有脂肪物，則也須去掉；
熱天提RNA，帶手套是必須的，手是RNase的主要來源；
組織塊用液氮研磨，效果，若沒有液氮或電動(dòng)勻漿器，可用手動(dòng)勻漿器代替，此時(shí)組織塊不宜過大，且需先用眼科剪刀將組織堿堿剪碎，然后再充分研磨。
6.1.2.1 肝臟、腸道、肌肉總RNA提取方法
①使用已高溫蒸汽滅菌的手術(shù)刀和鑷子從魚的腹部解剖開，從中取出完整的肝臟、腸、肌肉等組織，置于離心管后立即放入液氮中；
②組織在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mLTrizol的1.5ml離心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm離心15min；
③取上清移至新1.5ml離心管中，加入200ul氯fang，劇烈震蕩直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm離心15min；
④取上清移至新1.5ml離心管中，加入500ul異丙醇，輕輕顛倒10次，冰上放置20mins，于4℃，12,000rpm離心15min；
⑤棄上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水現(xiàn)配現(xiàn)用），于4℃，12000rpm離心5min，重復(fù)此步驟一次；
⑥棄上清后，室溫干燥5-7mins；
⑦加入適量（20-30ul）的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃（-80℃）保存，檢測RNA濃度，并電泳檢測。
6.1.2.2 RNA濃度測定和電泳檢測
取2ul提取好的RNA溶液，于Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter測定RNA濃度及A260/A280的相對(duì)吸光度，純凈RNA的A260/A280應(yīng)在1.8-2.2之間。
電泳檢測：1%瓊脂糖，1×ATE緩沖液，90V電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)觀察，分析結(jié)果。
6.1.2.3 肝臟、肌肉、腸道樣品cDNA的合成
反應(yīng)按照TaKaRa公司的PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，合成cDNA模板。
①基因組DNA的除去反應(yīng)，在PCR管中配置如下緩沖液。
試劑 用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μl
gDNA Eraser 1.0 μl
Total RNA X* ul
RNase Free dH2O up to 10 μl
X*：根據(jù)檢測到的RNA濃度來配置； 混合均勻后，室溫放置20-30min
②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在PCR管中配置如下緩沖液（20ul system），反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行。為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，進(jìn)行各項(xiàng)反應(yīng)時(shí)，先按反應(yīng)數(shù)+1的量配制Master Mix ，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中。
試劑 使用量
5×PrimeScript® Buffer 2（for Real Time） 4.0 ul
PrimeScript® RT Enzyme Mix I 1.0 μl
RT Primer Mix 1.0 μl
①的反應(yīng)液 10.0 ul
RNase Free dH2O up to 20 μl
③混合均勻后，在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：
37℃ 15 min 85℃ 5 sec
然后將得到的cDNA存放于-20℃冰箱保存待用。
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